Certificación de AESKULISA^® SARS-COV-2 NP IgG e IgM para SARS-COV-2 Mérida-Venezuela

El síndrome respiratorio agudo severo Coronavirus 2 causó una pandemia mundial de una magnitud incalculable, debido a su rápida extensión y riesgo de mortalidad, se hizo necesario contar con herramientas diagnósticas que contribuyeran a actuar de forma oportuna. El objetivo fue determinar el rendimiento diagnóstico de dos kits de metodología de ELISA de la casa comercial AESKU^® que detecta Anticuerpos NP IgM e IgG contra SARS-CoV-2 en el IAHULA. Se realizó un estudio retrospectivo para determinar el rendimiento analítico de los kits; para el procesamiento estadístico se usó el software estadístico SPSS IBM16^®. Para el kit NP IgG obtuvimos DO cal A < 0, 3 (DO = 0, 125); DO cal A < DO cal B < DO cal C < DO cal D; DO cal D > 1, 3 (DO = 2, 044); control negativo (DO = 0, 213) (ve 0 − 8 U/ml = 1, 89 U/ml) y control positivo (DO = 1, 586) (ve 25 − 75 U/ml = 48, 39 U/ml). La precisión fue 96,6 %, la exactitud 99 %, sensibilidad 94,30 % y especificidad > 99 %. Para el kit NP IgM obtuvimos DO cal A < 0, 3 (DO = 0, 084); DO cal A < DO cal B < DO cal C < DO cal D; DO cal D > 1, 3 (DO = 1, 995); control negativo (DO = 0, 126) (ve 0 − 8 U/ml = 1, 57 U/ml) y control positivo (DO = 1, 432) (ve 25 − 75 U/ml = 50, 3 U/ml). La precisión fue 96,6 %, la exactitud > 99 %, sensibilidad 92,7 % y especificidad > 99 %. Se comprobó que las características de AESKULISA^® SARS-CoV-2 NP IgG e IgM en documentos emitidos por el fabricante comprueban la calidad, exactitud, precisión, sensibilidad y especificidad para la determinación de anticuerpos para SARS-CoV-2 en suero humano.

Palabras clave: AESKU^®, anticuerpos de nucleocápside, certificación, COVID-19, SARS-CoV-2.

The severe acute respiratory syndrome Coronavirus 2 caused a global pandemic of incalculable magnitude, due to its rapid extension and risk of mortality, it is necessary to have diagnostic tools that contribute to acting in a timely manner. The objective was to determine the diagnostic performance of two ELISA methodology kits from the commercial house AESKU^® that detect Antibodies NP IgM and IgG against SARS-CoV-2 at IAHULA. A retrospective study was carried out to determine the analytical performance of the kits, for the statistical processing the statistical software SPSS IBM16^® was used. For the NP IgG kit we obtained OD st A < 0.3 (OD = 0.125); DO st A < DO st B < DO st C < DO st D; DO st D > 1.3 (DO = 2.044); negative control (OD = 0.213) (ev 0 − 8 U/ml = 1.89 U/ml) and positive control (OD = 1.586) (ev 25 − 75 U/ml = 48.39 U/ml). The precision was 96.6%, the accuracy 99%, sensitivity 94.30% and specificity > 99%. For the NP IgM kit we obtained OD st A < 0.3 (OD = 0.084); DO st A < DO st B < DO st C < DO st D; DO stD > 1.3 (DO = 1.995); negative control (OD = 0.126) (ev 0 − 8 U/ml = 1.57 U/ml) and positive control (OD = 1.432) (ev 25 − 75 U/ml = 50.37 U/ml). The precision was 96.6%, the accuracy > 99%, sensitivity 92.7% and specificity > 99%. It was verified that the characteristics of AESKULISA^® SARS-CoV-2 NP IgG and IgM in documents issued by the manufacturer prove the quality, accuracy, precision, sensitivity, and specificity for the determination of antibodies to SARS-CoV-2 in human serum.

Key words: AESKU^®, certification, COVID-19, nucleocapsid antibodies, SARS-CoV-2.

La enfermedad producida por el SARS-CoV-2 constituyó un reto para los sistemas de salud del mundo según la Organización Mundial de la Salud (OMS). En los tiempos de pandemia fue imprescindible disponer de pruebas que ayudaran a un diagnóstico temprano e incluso a detectar pacientes asintomáticos, lo cual fue clave para disminuir los contagios y evitar la propagación (Hart, 2020). Venezuela, al igual que otros países, ha vivido un gran impacto sociosanitario debido al SARS-CoV-2, cuya enfermedad ha sido conocida como COVID-19. Si bien el primer caso diagnosticado, confirmado y aislado se registró el viernes 13 de marzo del 2020, no fue sino hasta el 17 de marzo del mismo año, donde las autoridades decretan la cuarentena en la población en general. Para el momento actual en Venezuela, ya se han diagnosticado 552.499 casos positivos (que, a 1124 días de pandemia, serían unos 5 casos/día), 546.396 casos recuperados (un 98,87 % de los casos) y 5.856 fallecidos (un 1,05 % de todos los casos diagnosticados como positivos) (Patria Blog, 2023).

El diagnóstico de infección por SARS-CoV-2 en Venezuela se realiza mediante la prueba de reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa reversa (RT-PCR), la cual detecta la presencia del ARN viral, y, mediante pruebas inmunológicas que detectan inmunoglobulinas IgM e IgG contra la proteína de nucleocápside las cuales aparecen a partir de la segunda semana de infección. Se sabe que la prueba molecular (RT-PCR) es útil en las tres primeras semanas de infección y es actualmente el “standard de oro” recomendado por la Organización Mundial de la Salud (OMS/OPS, 2020); sin embargo, dicha prueba presenta ciertos inconvenientes de aplicación de tipo práctico, tales como: alto costo y sensibilidad variable, (dependiendo del tipo de muestra: un 93 % en el lavado bronco alveolar, 72 % en esputo, 63 % en hisopado nasal y 32 % en hisopado faríngeo) (Wang et al., 2020) y una baja sensibilidad a partir de la tercera semana de iniciados los síntomas (Yong et al., 2020).

Existen pruebas basadas en la detección de anticuerpos en sangre venosa y sangre capilar. Estas últimas denominadas “pruebas serológicas”. Sin embargo, la sensibilidad parece ser dependiente del momento de toma de muestra y de la aparición de los anticuerpos en sangre, y puede ser mayor al 90 % a partir de la segunda semana de síntomas. Su uso podría contribuir de manera significativa al diagnóstico clínico, particularmente en pacientes hospitalizados, en quienes las pruebas moleculares hayan resultado negativas (-), en falsos positivos (+) o que simplemente no se hayan realizado (Zhao et al., 2020).

El principal objetivo de este estudio es evaluar las características de desempeño del AESKULISA^® SARS-CoV-2 NP IgG e IgM que detecta anticuerpos IgG e IgM anti-SARS-CoV-2 por la metodología de ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay^®, Wendelsheim, Alemania) usando sueros controles con valores asignados y materiales de referencia. Este estudio es también el primer modelo de validación nacional descrito hasta la fecha y el primer estudio que informa del desempeño del AESKULISA^® Kit de IgM e IgG SARS-CoV-2 en el país.

Esta validación es un requisito para la asignación del registro sanitario lo cual permite la implementación rutinaria de esta prueba serológica en todos los laboratorios venezolanos al racionalizar su uso con fines clínicos. (Ley Orgánica de Procedimientos Administrativos, 1999).

Los inmunoensayos AESKULISA^® SARS-CoV-2 NP IgG e IgM son ensayos cualitativos y cuantitativos para la detección de anticuerpos IgG e IgM humanos en el suero o en el plasma contra proteína de la nucleocápside de SARS-CoV-2. AESKULISA^® SARS-CoV-2 NP IgM se utiliza para ayudar a detectar infecciones agudas y AESKULISA^® SARS-CoV-2 NP IgG permite confirmar el contacto con un agente patógeno y ayuda a determinar el estado inmunitario. (Aesku, 2020).

AESKULISA^® (AESKU Enzyme Linked Immunosorbent Assay) es un procedimiento inmunológico acreditado especialmente para la detección de anticuerpos. La reacción de detección se basa en la interacción específica de anticuerpos y antígenos. Con esta finalidad, las tiras de ensayo de las placas de micro titulación de AESKULISA^® están recubiertas con antígenos específicos de agentes patógenos infecciosos para la unión con los anticuerpos presentes en la muestra del paciente. Otros anticuerpos secundarios marcados con peroxidasa detectan los inmunocomplejos que se forman de este modo. La enzima cataliza una reacción en la que un sustrato incoloro se transforma en un producto de color (Figura 1). La potencia de señal del producto de la reacción es directamente proporcional a la actividad de anticuerpos en la muestra y se detecta mediante fotometría. (Gaudin et al., 2013).

La detección de anticuerpos con AESKULISA^® SARS-CoV-2 NP IgG e IgM se basa en el uso de la proteína de nucleocápside de SARS-CoV-2.

Se hizo un seguimiento preciso de las instrucciones para ası́ corroborar las caracterı́sticas establecidas por el fabricante. Para el uso adecuado de los inmunoensayos AESKULISA^® solo se utilizaron los reactivos AESKULISA^®. Estos no se intercambiaron por reactivos de otros fabricantes.

Las placas de micro titulación, los calibradores, los controles y los conjugados de los inmunoensayos AESKULISA^® que se utilizaron dentro del ensayo fueron de los lotes 20255 (ref. 6122) para la IgG y 20955 (ref. 6123) para la IgM, ya que por indicaciones del fabricante no se deben usar interlotes. Las valoraciones de los calibradores y controles se hicieron siguiendo el certificado de control de calidad (COA) (Tabla 1) y los criterios de validación del ensayo DO (Densidad óptica): DO CAL A < 0, 3; DO CAL A < DO CAL B < DO CAL C < DO CAL D; DO CAL D > 1, 3 para ambos lotes; Los controles negativos deben valorarse de forma negativa; Los controles positivos no deben valorarse de forma negativa; Para el uso cuantitativo de los inmunoensayos AESKULISA^® los controles positivos deben encontrarse en el perı́odo de validez que está indicado en el COA especı́fico de cada lote de AESKULISA^® ; Para el uso cualitativo de los inmunoensayos AESKULISA^® los valores de DO del calibrador de corte B (CAL B) de su análisis en duplicado no deben diferir entre sı́ en más de un 20 %.

Una valoración positiva de anticuerpos IgM contra la nucleocápside del SARS-CoV-2 confirman el contacto con el patógeno y es indicativo de una fase aguda por coronavirus 2. Una valoración negativa no descarta una infección por coronavirus y debe siempre compararse con la clı́nica del paciente y otros métodos diagnósticos. Una valoración indeterminada requiere que se repita el análisis de 7-10 dı́as.

Para evitar reacciones cruzadas o contaminaciones de los Kits, se utilizaron procedimientos basados en técnicas asépticas para la extracción de los reactivos. Se trabajó usando pipeteo inverso y puntillas nuevas. La reproducibilidad de los resultados dependió, entre otros, a la homogenización exhaustiva de los reactivos ante su uso, si no existe una dilución muestra-reactivo correcta según los principios básicos de trabajo, tendrı́amos una pérdida de sensibilidad de detección. Se cuidaron los niveles de temperatura los cuales oscilan entre 20-30 ◦C estandarizando para el estudio 22,2 ◦C.

Durante el almacenaje y la incubación, los reactivos se protegieron de fuentes de luz intensa. Nunca se expusieron a temperaturas superiores a 37 ◦ C. Después de su uso, los reactivos se cerraban bien para evitar que se secaran o contaminaran.

Las muestras de sangre se recolectaron en tubos de suero (BD Vacutainer SST II advance, BD, Plymouth, Reino Unido) de acuerdo con el procedimiento operativo estandarizado. A continuación, las muestras se centrifugaron a 3500 rpm durante 10 min, se recogió el suero, las muestras se analizaron de forma inmediata. En caso de que los análisis se retrasaran, las muestras se alicuotaron y almacenaron entre 2 y 8 ◦ C durante un máximo de 3 dı́as. Si el almacenamiento fue superior a 3 dı́as, la muestra de suero se almacenó a -20 ◦ C.

Las muestras congeladas se descongelaron una hora antes de su procesamiento a temperatura ambiente el dı́a del análisis, evitando congelar y descongelar más de una vez. Las muestras descongeladas se agitan y centrifugan antes del análisis. Los sueros no se inactivaron antes de medir los anticuerpos.

Se realizaron los análisis siguiendo las instrucciones de los fabricantes, se analizaron muestras de suero referenciales, de pacientes con RT-PCR positivos y RT-PCR negativas; ası́ como también con valores asignados por quimioluminiscencia. Los sueros controles utilizados son parte del panel de referencia que se encuentran en el Laboratorio de Hormonas y pruebas especiales del Instituto Autónomo del Hospital Universitario de Los Andes (IAHULA).

El análisis cuantitativo y cualitativo de los anticuerpos IgM e IgG anti-SARS-CoV-2 dirigidos contra proteı́na de la nucleocápside del virus se realizó con el kit AESKULISA^® SARS-CoV-2 NP IgG e IgM mediante metodologı́a de ELISA en un Autobio PHOMO^® analizador de microplacas, para el lavado se utilizó un lavador modelo Elx50 marca Biokit. Para cada placa ELISA, se calculó una relación entre la extinción de las muestras de suero y los calibradores en duplicado (Tabla 2). Los criterios de interpretación proporcionados por los fabricantes se encuentran en la Tabla 3.

La evaluación del rendimiento se realizó de acuerdo con el documento EP 15-A3 del Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2014), y los protocolos de trabajo del Instituto Nacional de Higiene Rafael Rangel. Los criterios de aceptación se definieron de acuerdo con el desempeño informado por el fabricante y se resumen en la Tabla 4.

Los datos fueron procesados con el software estadı́stico SPSS IBM16^® y software de hojas de cálculo de uso común. Además, se midieron los coeficientes de variación, sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo y valor predictivo negativo intraensayo para evaluar la repetibilidad, el rendimiento y la precisión del ensayo diseñado internamente.

El diagrama de dispersión entre el logaritmo de las absorbancias o densidad óptica DO (eje y) y los valores de concentración logarı́tmica (U/mL) (eje x), se muestra en la Figura 2 como puntos múltiples que caen a lo largo de una lı́nea recta como una curva estándar, los mismos se trazan a partir de los datos de la Tabla 5 que incluye el promedio de absorbancia de DO de cada estándar y la Tabla 6 los controles negativos y positivos para de anticuerpos de nucleocápside IgG e IgM de los kits.

Lo niveles de los controles de calidad bajos mostró un valor medio de 1, 73 ± 0.01 U/mL sobre 20 muestras analizadas. El alto nivel de control de calidad mostró un valor medio de 49, 37 ± 0, 02 U/mL. Estos resultados concuerdan con los criterios de aceptación y están en lı́nea con las especificaciones proporcionadas por el fabricante. Sin embargo, el fabricante no proporciona un grado de incertidumbre para los niveles de control de calidad negativos, sino que solo informa un rango, lo que impide una evaluación adecuada de la veracidad para los controles negativos. Se calculó un error relativo del 1,26 % para el control positivo, a menor sea el porcentaje de error relativo mayor es la veracidad del método. (Tre-Hardy y Alan, 2020).

La precisión se determinó calculando la media, la DE y el CV para cada conjunto de mediciones repetidas de concentración entre análisis (Behnke et al., 2019). Para que el punto de decisión se considere válido, la media ± 2 SD para cada concentración no deben superponerse. La precisión calculada para IgG fue de 96,6 %, y para la IgM 96,6 %.

La sensibilidad y la especificidad diagnostica de los kits se determinaron mediante la proporción de individuos que poseen pruebas positivas estando enfermos y la proporción de pruebas negativas estando sanos; la precisión y exactitud del control, se verificaron comparando los valores esperados con los valores obtenidos y la reproducibilidad de éste, como se muestra en la Tabla 8.

La validación cualitativa se realizó mediante la comparación de la DO de la muestra del paciente con la DO media del calibrador B, analizados por duplicados, (calibrador de corte CAL B), si la densidad óptica de la muestra del paciente se sitúa en un rango ± 20 % del promedio de la DO del calibrador B, éste se considerará como borderline o dudoso, en caso de que la DO sea más elevada, la muestra del paciente se considerará positiva y en el caso que la DO sea más baja se considerará negativa. El valor del calibrador B tanto para el IgG como para la IgM no difieren entre sı́ del 20 %. (Tabla 9)

Se realizó la medición de las densidades óptica en un plazo de 30 minutos a 450 nm con un diferencial de 630 nm, para comprobar la estabilidad en el tiempo de lectura que indica el fabricante y se muestra en la Figura 3.

En este estudio, las caracterı́sticas de rendimiento del ensayo ELISA de anticuerpos de nucleocápside de AESKULISA^® SARS-CoV-2, se validaron al observar la concordancia cualitativa y cuantitativa de sus resultados para los paneles de suero referenciales con los del ensayo comercial de anticuerpos de nucleocápside IgG e IgM anti-SARS-CoV-2.

El análisis cualitativo desarrollado en el ensayo es de tipo instrumental por lo que en este sistema de medidas la respuesta que se obtienen se tiene que transformar en una respuesta binaria del tipo SI/NO por lo tanto no implica un tratamiento de datos, más allá de determinar la presencia o la ausencia de los anticuerpos en los sueros pacientes (Ruisánchez et al., s.f.).

No hubo cambios en las lecturas realizadas en los diferentes tiempos seleccionados durante el intervalo de lectura establecido por el fabricante, comprobando ası́ la estabilidad de la reacción dentro de los cero a los treinta minutos una vez agregada la solución de parada.

Se comprobó que las caracterı́sticas de los kits AESKULISA^® SARS-CoV-2 NP IgG e IgM de la casa comercial AESKU^® , especificadas en los insertos y otros documentos emitidos por el fabricante, ası́ como el uso que le hemos dado, comprueban la calidad, exactitud, presión, sensibilidad y exactitud para la determinación de anticuerpos de nucleocápside IgG e IgM contra SARS-CoV-2 en suero o plasma humano. Es importante señalar que toda prueba de ELISA proporciona resultados preliminares y los resultados negativos no exentan una infección por SARS-CoV-2 y no pueden utilizarse como base de diagnóstico definitivo.

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